DOI: https://doi.org/10.51431/bbf.v9i2.614

ARTÍCULOS

Tolerancia a estrés salino bajo condiciones in vitro de lechuga (Lactuca sativa L.) inducidas a poliploidía

Tolerance to saline stress under in vitro conditions of lettuce (Lactuca sativa L.) inducedto polyploidy

Alexis Argüelles Curaca
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Escuela Profesional de Biología, Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión, Huacho, Perú.

Angel David Hernández-Amasifuen
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Escuela Profesional de Biología, Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión, Huacho, Perú.

Anthony Apolinario Cortez Lázaro
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Escuela Profesional de Biología, Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión, Huacho, Perú.

Mariella Antonella Ramírez Laos
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Escuela Profesional de Biología, Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión, Huacho, Perú.

Hermila Belba Díaz Pillasca
Laboratorio de Biotecnología Vegetal, Escuela Profesional de Biología, Universidad Nacional José Faustino Sánchez Carrión, Huacho, Perú.

RESUMEN

Objetivo: Determinar la tolerancia a estrés salino bajo condiciones in vitro de lechuga var. Crespa (Lactuca sativa L.) inducidas a poliploidía. Materiales y Métodos: Las semillas de lechugas fueron sometidas a una desinfección con alcohol al 70% por 60 segundos, hipoclorito de sodio en concentración de 1,5% finalizando con un lavado con tween 20 para luego ser establecidas en un cultivo in vitro, posteriormente al observar las raíces fueron inducidas a la duplicación cromosómica con colchicina volviendo a establecer los explantes en un cultivo in vitro adicionados con diferentes concentraciones de NaCl (0, 50 y 100 mM) Resultados: Se obtuvo germinación del 100% sin presentar contaminantes, mediante el estudio de cariotipo se observó plantas diploides, posterior al someterlas con colchicina se logró la duplicación cromosómica de los explantes de lechuga, los cuales inicialmente eran diploides (2n = 18), y se determinó que los explantes inducidos a la poliploidia mostraron mayor peso seco por explante y área foliar. Conclusión: Se determinó que las plántulas de lechuga var. Crespa inducidas a duplicación cromosómica presentaron mayor tolerancia a estrés salino, porque se expresó una mayor área foliar y peso fresco en los explantes a comparación de los explantes que no fueron inducidos.

Palabras claves: lechuga, Lactuca sativa, poliploidía, tolerancia, salinidad, colchicina.

ABSTRACT

Objective: To determine tolerance to salt stress under in vitro conditions of lettuce var. Crespo (Lactuca sativa L.) induced to polyploidy. Materials and Methods: The lettuce seeds were subjected to a disinfection with 70% alcohol for 60 seconds, sodium hypochlorite in a concentration of 1.5%, ending with a wash with tween 20 and then being established in an in-culture. In vitro, after observing the roots, they were induced to chromosomal duplication with colchicine , re-establishing the explants in an in vitro culture added with different concentrations of NaCl (0, 50 and 100 mM). Results: Germination of 100 % without presenting contaminants, diploid plants were observed through the karyotype study, after subjecting them with colchicine, chromosomal duplication of lettuce explants was achieved, which were initially diploid (2n = 18), and it was determined that the explants induced by Polyploidy showed higher dry weight per explant and leaf area. Conclusion: It was determined that the seedlings of lettuce var. Crespa induced to chromosomal duplication showed greater tolerance to saline stress, because a greater leaf area and fresh weight were expressed in the explants compared to the explants that were not induced.

Keywords: Lettuce, Lactuca sativa, polyploidy, tolerance, salinity, colchicine.

INTRODUCCIÓN

En la actualidad, la salinidad es el factor medioambiental más importante que limita el establecimiento y productividad de las plantas provoca en las plantas un sinnúmero de efectos fisiológicos, morfológicos y bioquímicos, tales como disminución de la fotosíntesis y cambios cuantitativos y cualitativos en la síntesis de proteínas por cambios en la expresión de genes a causa de la salinidad, entre otros (Allakhverdiev et al., 2000; Singh & Chatrath, 2001). Otra respuesta fisiológica de las plantas a la salinidad se da disminuyendo la conductancia estomática; de esta forma se reduce la transpiración evitando la sequía fisiológica para mantener la turgencia de las células. La reducción de la conductancia estomática implica el cierre de las estomas y se relaciona, entre otros factores (luz, humedad, CO², temperatura y corrientes de aire), con la disminución del potencial de agua foliar, incluso por encima de la luz intensa. El cierre de las estomas reduce el ingreso de CO² inhibiendo la fotosíntesis, dando como resultado la reducción en la síntesis de fotosintatos. En general, la consecuencia es la disminución en la producción de biomasa, como raíces, hojas, tallos y semillas, relacionados con el área foliar y la longitud de plantas (Savvas & Lenz, 2000).

La lechuga (Lactuca sativa L.) pertenece a la familia Compositae; es un alimento que aporta muy pocas calorías, alto porcentaje de agua (90-95%), vitaminas (folatos, pro vitamina A o beta-caroteno y cantidades apreciables de vitamina C), Minerales (potasio y magnesio) y fibra. La planta es anual y autógama, su raíz no llega nunca a sobrepasar los 25 cm. de profundidad, es pivotante, presenta tallo corto cilíndrico y ramificado, la inflorescencia está compuesta por capítulos florales amarillos dispuestos en racimos o corimbos. En cuanto al clima, la lechuga puede desarrollarse a temperaturas de 6˚ C.; con mucha dificultad. Es por eso que los climas templados frescos, con temperaturas promedio mensuales entre 13˚ y 18˚C, permiten su cultivo durante todo el año, aunque elevadas temperaturas también limitan su desarrollo considerablemente (La Rosa, 2015).

Esta especie vegetal es relativamente sensible a la salinidad, pero tal tolerancia a las sales con frecuencia varía dentro de la misma especie. Los valores umbral para las especies de lechuga están en el rango de 1,0 a 1,4 dS m^-1, y la pendiente para la disminución del rendimiento, desde 6,2 hasta 8% por dS m^-1 (Archila et al., 1998).

La poliploidía es un fenómeno natural que ocurre con más frecuencia en las plantas que en los animales y se le considera un mecanismo fundamental en la evolución de las especies nuevas. Alrededor del 40% de especies de plantas florales y entre el 70 y 80% de las hierbas son poliploides. Muchas plantas que actualmente se cultivan y explotan para la alimentación mundial también son poliploides. En el caso de la inducción a la poliploidía, es un procedimiento que le brinda al fitomejorador la oportunidad de modificar una planta alterando el número de cromosomas y, en consecuencia, la proporción de genes alélicos que contribuyen al aparecimiento de caracteres particulares (Cubero, 2003; Borini et al., 2010. Cavalcanti, 2011). Plantas de yuca obtenidas por tratamiento de colchicina mostraron diferencias en el tamaño de las estomas cuando se compararon con el testigo, según la correlación entre el número cromosómico y el tamaño de las estomas observada en otras plantas, se pudo encontrar un grupo de plantas poliploides de yuca (Graner, 1940); teniendo así precedentes de una alternativa de detección en plantas inducidas a la poliploidía.

El uso de la técnica de inducción de la poliploidía en la mejora de plantas de interés agrícola, ha tenido resultados prometedores en gran parte de las investigaciones con esta técnica, como Matos (2014) quien logro mejorar la producción de sábila en cantidades de 3 a 6 veces mayor en comparación con las plantas diploides. Teniendo en cuenta la problemática que genera la salinidad en cultivos vegetales, es que se pretende determinar la tolerancia a estrés salino bajo condiciones in vitro de lechuga variedad Crespa inducidas a poliploidia.

Tabla 1. Tratamientos para la determinación de tolerancia a salinidad

Las variables a evaluar fueron el peso fresco por plántula (PFP) y el área foliar (AF) de las plántulas transcurridas los 30 días de transferencia a los tratamientos de estrés salino. Los datos obtenidos fueron estudiados mediante análisis de varianza (ANVA) y prueba de comparación de medias (Tukey, P ≤ 0.05).

RESULTADOS

Se logró germinar la lechuga en condiciones in vitro sin problemas de contaminación de bacterias u hongos. El estudio del cariotipo de los explantes germinados indico que las variedades empleadas eran diploides (2n = 18), mientras que luego de ser sumergidas en colchicina se obtuvieron variaciones en las estructuras cromosómicas (Figura. 1).

Las plántulas que no fueron inducidas con colchicina también fueron incididas para mantener una experimentación homogénea. Las plántulas en los medios de cultivo posterior a la incisión continuaron con su crecimiento, sin presentar necrosis o contaminación microbiana (Figura. 2).

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal consistió en semillas de lechuga de calidad y de variedad crespa obtenida de una tienda semillera en la Provincia de Huaura, departamento de Lima. Posteriormente se trasladaron las semillas a las instalaciones del Laboratorio de Biotecnología Vegetal de la E.A.P Biología con mención en Biotecnología para su introducción in vitro.

Primero se realizó un proceso de pre-desinfección a las semillas durante 5 minutos con detergente y se mantuvo agitando ligeramente la desinfección dentro de la cámara de flujo laminar, donde se desinfecto con alcohol al 70 % durante 1 minuto y se enjuago con agua destilada, posteriormente se sumergió en hipoclorito de sodio al 1.5 % durante 10 minutos, se añadió también una gota de tween 20, y finalmente se enjuago 3 veces con agua destilada estéril (Hernández-Amasifuen, Pinedo-Lázaro & Díaz-Pillasca et al, 2019).

Una vez realizada la desinfección de las semillas se llevó a continuación la siembra de las semillas en frascos con medio de cultivo MS (Murashige & Skoog, 1992), cuyo pH fue regulado a 5.8 y se almaceno en la cámara de incubación a 22 °C reguladas por fotoperiodos de luz. En total se sembró 30 frascos.

Cuando se apreciaron las primeras raíces de las plántulas germinadas se procedió a la inducción de duplicación cromosómica, para lo cual las plántulas fueron transferidas a medios líquidos con colchicina durante 24 horas. Posteriormente se realizó en análisis cromosómico para determinar la confirmación de la duplicación. Confirmada la duplicación cromosómica las plántulas fueron transferidas a medios de cultivo MS, adicionados con diferentes concentraciones de NaCl (Tabla 1).

Figura 1. Variaciones en las estructuras cromosómicas en lechuga inducidas a poliploidía.

Figura 2. Explantes de lechuga inducidas a poliploidía (izquierda) y no inducidas (derecha) en las primeras semanas de los medios de cultivo para evaluar el estrés salino.

Por observaciones macroscópicas las lechugas inducidas presentar incremento de tamaño de sus estructuras. En la evaluación de las lechugas inducidas y no inducidas en el medio de cultivo MS sin adición de NaCl, se presento un incremento de mayor peso seco y área foliar en las plantas de lechuga inducidas a poliploida. Además, se logró determinar que los explantes de lechuga que fueron inducidos a poliploidia mostraron mayor peso seco por explante y área foliar transcurrido 30 días bajo condiciones de estrés salino in vitro (Tabla 2).

Los explantes inducidos presentaron una reducción del 12% de peso seco por plántula en los tratamientos con 50 mM de NaCl, pero en los tratamientos con 100 mM se presentó una reducción del 20%. Mientras que los explantes no inducidos presentaron una reducción del 23% y 42% de peso fresco por planta en los tratamientos con 50 mM y 100 mM de NaCl respectivamente. En las plántulas inducidas a poliplodia se determinó una reducción en porcentaje del peso fresco por planta a comparación de las lechugas que no pasar por el proceso de inducción con colchicina (Figura. 3a).

Tabla 2. Evaluación de las variables en estudio en diferentes tratamientos bajo estrés salino

PFP: Peso Fresco por Plántula; AF: Área Foliar. Medias con la diferente letra en cada columna difieren estadísticamente (Tukey p ≤ 0.05).

En la comparación entre el porcentaje de reducción en el área foliar por planta en el caso de los explantes inducidos se presentó una reducción del 10% y 34% en los medios de cultivos MS adicionados con 50 mM y 100 mM de NaCl respectivamente. En el caso de las lechugas que no fueron inducidas se presentó una reducción del 14% y 47% en los medios de cultivos MS adicionados con 50 mM y 100 mM de NaCl respectivamente. Determinándose que también se ha logrado reducir el porcentaje de reducción en el área foliar, en otras palabras, esto podría compararse a que se logró disminuir la reducción del tamaño de los explantes por efecto del estrés salino (Figura. 3b).

Figura 3. Comparación entre lechugas inducidas y no inducidas en tres diferentes tratamientos de NaCl. Por de peso fresco por plántula (a) y área foliar (b).

DISCUSIÓN

En el proceso de desinfección de semillas de lechuga no se presentaron contaminaciones por bacterias ni por hongos filamentosos, es debido a la acción que tiene el alcohol e hipoclorito de sodio frente a los microorganismos presentes en la superficie de los explantes iniciales. De esta manera empleando estas soluciones en las concentraciones adecuadas se puede eliminar a los patógenos sin causar daños a los explantes, para eso es necesario determinar protocolos de desinfección para cada tipo de explante y cada especie, así como realizar agitaciones constantes para una mayor difusión de las soluciones en todos los explantes durante el proceso de desinfección (Hernández-Amasifuen et al., 2020)

El estudio de cariotipo antes de realizar el tratamiento con la colchicina indico que las plántulas eran diploides (2n = 18), esto corresponde con lo afirmado por Archila et al. (1998), que en la lechuga se mantiene la estabilidad genética y cromosómica en condiciones in vivo e in vitro. Posteriormente luego de aplicar la colchicina a los explantes, se obtuvo variación en las estructuras cromosómicas, obteniendo resultados similares a Molero & Matos (2008), quienes inducieron a poliploidía a Aloe vera L. mediante diversos tratamientos con colchicina con el objeto de inducir tetraploidía en condiciones ex vitro a partir de plantas diploides. Los individuos poliploides se vuelven viables luego de superar la inestabilidad genética (Wang et al., 2006), tal como se contrasto en plántulas inducidas de lechuga.

Tanto el área foliar como el peso fresco por explante expresadas en la figura 3 respectivamente presentaron una disminución, ya que estos parámetros dependen de la expansión celular, las cuales a su vez están relacionados a la masiva división celular, pero al encontrarse en un medio de diferencia osmótica podría afectar la tasa de crecimiento de las hojas (Munns, 2002). Además, el transporte de iones de sodio a las células en división puede afectar los procesos celulares y consigo los fisiológicos, al existir un incremento de la concentración de sodio en el tejido en crecimiento, más aún en especies que presentan sensibilidad a la salinidad como es la lechuga (Medrano & Flexas, 2003).

Las lechugas inducidas presentan un incremento en el peso seco por explante y área foliar, así como menor efecto en la reducción de las dos variables en estudio por efecto de las concentraciones de sales en el medio de cultivo. Esto permite tener un panorama de la posibilidad de las plantas inducidas a poliploida a superar la pendiente de disminución de rendimiento (Archila et al., 1998).

El estudio en la búsqueda de mayor tolerancia a estrés salino en lechuga permite cada vez emplear nuevos métodos de mejoramiento genético, que finalmente podrán resultar en material vegetal de alta calidad, explotar y aprovechar más sus usos agroalimentarios. Tal como Bracho G. (2019) que explora diferentes alternativas para obtener especies poliploides motivado por la obtención de mejores productos vegetales.

CONCLUSIÓN

Se determinó que las plántulas de lechuga variedad Crespa inducidas a duplicación cromosómica presentaron mayor tolerancia a estrés salino, porque se expresó una mayor área foliar y peso fresco en los explantes a comparación de los explantes que no fueron inducidos.

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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Recibido: 02/03/2020

Aprobado: 16/03/2020